Ученые открыли механизм «темного состояния» зеленого флуоресцентного белка

Молекулы, способные под действием света испускать собственное свечение — флуоресценцию, широко применяются в биомедицине в качестве молекулярных датчиков. При облучении они переходят в возбужденное состояние, а их электронная структура меняется, позволяя расходовать поглощенную энергию на излучение. Однако помимо «ярких» состояний существуют «темные»: в них невозможно попасть напрямую из основного состояния, просто поглотив свет, и из них нельзя выйти с испусканием света. Как показали исследования, такие состояния служат ловушкой для избыточной энергии, перехватывая ее и временно удерживая, а затем рассеивая в тепло. Это предотвращает разрушение светочувствительной молекулы. До сих пор данные о том, как вещество переходит в «темное» состояние и выходит из него, отсутствовали, что ограничивало возможности управлять процессом и настраивать фотозащитные свойства молекул.

Как удалось «выключить» свечение

Авторы работы, объединившей усилия ученых из Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, Университета Дарема (Великобритания) и Орхусского университета (Дания), впервые детально проследили за возникновением «темного» состояния в модифицированном хромофоре зеленого флуоресцентного белка. Этот белок биологи используют в качестве светящейся метки для отслеживания работы генов и белков, а также наблюдения за ростом опухолей. Результаты исследования, поддержанного грантом Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в Journal of the American Chemical Society.

Ученые изменили структуру хромофора так, чтобы целенаправленно создать в нем «темное» состояние — долгоживущую электронную конфигурацию, из которой испускание света подавлено. Для этого они передвинули одну из химических групп в хромофоре в другое положение, что усилило склонность молекулы к внутримолекулярному переносу заряда при возбуждении. Затем исследователи поместили модифицированные отрицательно заряженные хромофоры в электростатическое ионное накопительное кольцо — устройство, где молекулярные ионы находятся в глубоком вакууме и полностью изолированы от любых внешних воздействий. После этого на хромофоры подействовали сверхкороткими лазерными импульсами, переводя их в возбужденное электронное состояние.

В таких «стерильных» условиях ни одна особенность поведения вещества не маскируется взаимодействием с окружением, что позволяет буквально проследить за судьбой каждой молекулы от момента поглощения фотона до заселения «темного» состояния и возвращения в основное. Оказалось, что после возбуждения до «яркого» состояния хромофор переходит в «темное» всего за 100 фемтосекунд — время, в десять триллионов раз меньше секунды, — и остается в нем почти 100 пикосекунд. По меркам внутримолекулярных процессов это очень долгий период.

Природный механизм фотостабилизации

«Это состояние работает как молекулярный предохранитель — сверхбыстрая энергетическая ловушка. Оно позволяет перехватить избыточную электронную энергию и избежать разрушения молекулы. Секрет защиты от ультрафиолета кроется в синхронной сверхбыстрой перестройке электронов и ядер в молекуле. Это предотвращает распад молекул на опасные свободные радикалы и электроны», — пояснила руководитель проекта Анастасия Боченкова, кандидат физико-математических наук, заведующая лабораторией квантовой фотодинамики и доцент кафедры физической химии химического факультета МГУ.

Аналогичный защитный механизм известен в каротиноидах — природных пигментах, работающих в фотосинтетических комплексах растений и бактерий. В искусственно модифицированном хромофоре авторам удалось воспроизвести высокоэффективный природный механизм ультрабыстрого «переключателя» для активации фотозащиты. Однако в отличие от каротиноидов у модифицированного хромофора темное состояние сочетается со значительным переносом заряда внутри молекулы. Ученые подчеркивают, что благодаря такому переносу заряда «темным» состоянием можно управлять, меняя окружение молекулы, например, растворитель или структуру белка вокруг хромофора.

На практике это открывает новые возможности для создания сверхпрочных полимеров, устойчивых к ультрафиолетовому излучению, и биосенсоров, которые должны быстро и точно переключаться между включенным и выключенным состояниями. «В дальнейшем мы планируем исследовать, как именно полярность и природа окружения влияют на динамику и время жизни “темного” состояния в химически модифицированных хромофорах. Сопоставление данных, полученных в газовой фазе, с поведением хромофора в растворах и белках позволит построить количественную модель настройки фотозащитных свойств», — добавила Боченкова.